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本试剂盒采用SYBR Green I嵌合荧光染料法的原理来进行miRNA荧光定量PCR检测。试剂盒包括检测所需的2×miRNA qPCR premix和Reverse primer。2×miRNA qPCR premix是专门为miRNA定量检测而研发的新一代预混形式的荧光定量PCR检测试剂，所含的荧光染料SYBR Green I可以与所有的双链DNA结合，使该产品可用于不同靶序列的检测而不需合成特异性标记探针。其中的BaldStar Taq DNA polymerase是经化学修饰的高效热启动酶，配合独特的缓冲体系，使反应特异性更好，灵敏度更高，并能在更广的范围内对miRNA进行准确定量。

• 试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。
  
• miRNA第一链cDNA的加入量不要超过Real time PCR体积10%。
  
• 对于特殊的检测体系，高含量的cDNA模板易导致非特异性扩增，根据所检测miRNA的丰度适当的稀释cDNA(稀释10倍或者100倍)。
  
• 本制品中的2×miRNA qPCR Mixture中含有SYBR Green I和ROX染料，保存本制品或配制PCR反应液时应避免强光照射。
  
• 避免反复冻融本制品，反复冻融可能使产品性能下降，本制品长期保存可置于-20℃。如果在短期内需要频繁使用，2×miRNA qPCR Mixture可于2～8℃保存。而Reverse primer仍需置于-20℃保存。
  
• 本试剂盒须与miRNA cDNA第一链合成试剂盒(货号：WE0157)配套使用。

• 遵循引物设计的最普遍原则。
  
• 以成熟的miRNA序列为基础，将U替换成T，这是最基础和最简单的设计方法。
  
• 试剂盒中提供的下游引物的Tm值为63.6℃，设计上游引物的Tm值要尽量保证在63.6℃左右。
  
• 若按照原则“2”的方式直接设计的引物其Tm值过低，可以在引物的5’端添加几个碱基(最好为G或C碱基)；也可以在3’端添加1个或几个A碱基；或者5’端和3’端同时修饰。
  
• 若按照原则“2”的方式直接设计的引物其Tm值过高，可以在引物的5’或3’端去掉几个碱基。

• 室温融化2×miRNA qPCR Mixture和Reverse primer(10μM)。
  
• 使用时请将2×miRNA qPCR Mixture上下颠倒轻轻均匀混合，避免起泡，并经短暂离心后使用。如果试剂没有混匀，其反应性能会有所下降。
  
• 将试剂置于冰上，并按下表配制反应体系：
  

  成分	用量	终浓度
  2×miRNA qPCR Mixture(ROX)	10μL	1×
  Forward primer(10μM)	0.4μL	0.2μM
  Reverse primer(10μM)	0.4μL	0.2μM
  miRNA第一链cDNA	X μL	—
  ddH2O	至20μL	—

• 反应程序设置如下：
  注意：本制品预变性反应必须在95℃ 10分钟下完成！
  

  步骤	温度	时间	循环数
  预变性	95℃	10min	1
  变性	95℃	15 s	40～45
  退火/延伸	60℃	1min
  溶解曲线分析	根据PCR仪要求设定

  注意：
  
  • 本制品所采用的热启动酶须在预变性95℃、10min条件下实现酶的活化。
    
  • 退火温度请以60～64℃作为设定范围的参考，发生非特异性反应时，可提高退火温度。